1868年1月11日，蔡元培出生在浙江省绍兴府山阴县(今绍兴市越城区萧山街笔飞弄13号)一个比较富裕的家庭。1892年，25岁的蔡元培经殿试进士及第，被点为翰林院庶吉士，殿试策论成绩为二甲三十四名，光绪帝师翁同龢称赞他是“年少通经、文极古藻”。1894年春，蔡元培应散官试，被授职翰林院编修。

受维新思想影响，蔡元培屡屡向朝廷提出革新图强的建议，却丝毫没有被采纳。“百日维新”后，维新派人物遭到顽固派镇压。残酷的现实使蔡元培感觉到，需要培养一批年轻人，形成一个组织或团体，才有力量与清政府作斗争。基于此种理念，他弃官回乡，从事教育工作，先后出任绍兴中西学堂监督、嵊县剡山书院院长。

1900年夏天，蔡元培离开故乡前往上海，成为上海南洋公学特班总教习。1902年4月，蔡元培与蒋观云、章太炎等创办了中国教育会，他担任了会长。同年11月下旬，上海南洋公学因压制学生思想言论自由，发生了200多名学生的退学风波，学校当局将学潮的责任推到蔡元培的头上，说与他平时在学生中提倡民权有关。

出于对当局的不满，蔡元培愤然退出了南洋公学，着手创办爱国学社、爱国女校。由于办学经费不足，他不顾儿子病重，外出筹款。他刚到码头，家人就来报信说儿子刚刚去世。为不耽误时间，蔡元培委托中国教育会的同事办理儿子的后事，挥泪登上了开往南京的轮船。经过他的努力，几天后便带着借来的6000元办学经费回到上海。他在爱国女学校开学典礼演说中阐述办学的宗旨时强调：“本校初办时，在满清季年，含有革命性质。革命精神所在，无论其为男为女，均应提倡，而以教育为根本。”

1903年初，杭州求是学堂(浙江大学的前身)、南京江南陆师学堂等校学潮风起云涌，蔡元培给予声援和多方支持。他与蒋观云、章太炎等创办的中国教育会、爱国学社、爱国女校等，积极开展爱国、反帝革命活动，师生平时高谈革命，言论极其自由。中国教育会还在江苏创办分会、学堂等，与爱国女校相互配合，共同反清，发展势头良好。

为反对沙俄入侵东三省，蔡元培还在章太炎等创办的《苏报》上撰写文章，揭露清政府的腐败专制。他指出：“中国人现在有家无国，应该造就一个强大的新中国。”他还与上海反清人士以对俄同志会的名义，创办了《俄事警闻》(后改《警钟日报》)，声讨俄、日霸占东三省的罪行。与此同时，爱国学社还组建了抗俄义勇队，蔡元培剪了头发，身穿制服，天天与学生们在一起进行军事操练。这些活动很快引起了清政府的警觉，当局下令对其侦讯，蔡元培只好辗转青岛、绍兴、上海等地，甚至出走日本，其间仍继续从事教育和革命活动。

得知章太炎和爱国学社成员邹容被捕的消息，蔡元培义愤填膺。他认为：改良主义在中国行不通，必须采取暴力行动，才能推翻清政府。他参与组建了“军国民教育会暗杀团”，将爱国女校作为联络革命党人的据点、组织暗杀敌人和革命暴动的机关，向高年级学生讲授法、俄近代史和一些暗杀知识，并与陈独秀、章士钊等革命者在密室中学习制造炸药等武器，准备暗杀清廷大员。

1904年冬天，蔡元培与同乡陶成章等商定，将原来的“军国民教育会暗杀团”改组扩大为光复会，他当选了光复会会长，并吸收徐锡麟、秋瑾为光复会骨干，此后又吸收朱瑞、吕公望等一批人士为光复会会员，壮大了光复会的组织和力量。1905年10月，孙中山接见并委任蔡元培为同盟会上海分会负责人。由于他在江浙沪一带声望很高，为光复会、同盟会组织的建设和开展一系列革命活动发挥了重要作用。

在多年从事革命活动中，蔡元培逐渐意识到：对知识分子来说，必须用新的思想、新的知识武装自己。要像孙中山那样，到国外去学习先进的文化知识，用新的观念、新的方法观察中国的现象、解决中国的问题。1907年5月，蔡元培前往德国莱比锡大学留学，并研究心理学、美学、哲学诸学科知识。在德4年，他编著了《中国伦理学史》等一批学术书籍，为未来的学术生涯奠定了坚实的基础。

辛亥革命爆发后，蔡元培从陈其美处得到消息，马上取道西伯利亚回国。随着中华民国临时政府在南京成立，蔡元培就任南京临时政府教育总长。教育部在蔡元培领导下对公众征求可能的国歌，后来颁布了由沈恩孚作词、沈彭年谱曲的国歌拟稿，歌名叫《五旗共和歌》。次年1月19日，蔡元培颁布了《普通教育暂行办法》，强调要把中学和大学建设成健全国民的学校，并主持制定了中国史上最初的《大学令》和《中学令》。

1912年7月，蔡元培因不愿与袁世凯政府合作而辞职，再次赴法国从事学术研究。在留欧的3年时间里，又编撰了不少哲学、美学著作。1915年6月，蔡元培与李石曾、吴玉章等发起组织华法教育会，倡导勤工俭学，希望借此依次组织帮助更多华人青年到欧洲求学，开阔视野。

1916年，北京政府明令恢复《临时约法》，孙中山、黄兴等革命党人纷纷回国。这年11月8日，蔡元培与吴玉章一起乘船由马赛回到上海。同年12月26日，49岁的蔡元培受命担任北京大学校长。次年1月，蔡元培发表就任北京大学校长的演说，他对学生提出三点要求：一是抱定宗旨，二是砥砺德行，三是敬爱师长。上任后，蔡元培即聘请《新青年》主编陈独秀为文科学长，并聘请李大钊、胡适、钱玄同等“新派”人物在北大任教，采用“思想自由，兼容并包”的办学方针，实行“教授治校”的制度，提倡学术民主，支持新文化运动，努力改变北大的混乱局面。

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从1917年1月开始，蔡元培先后三度担任了北京大学校长。随着1919年巴黎和会上列强将德国在山东的权益转交给日本的消息传来，五四运动爆发，蔡元培领导北大师生同北洋政府的卖国行径进行了坚决的斗争。当权者恼羞成怒，扬言要烧北大的房子，并扬言以300万现金买凶暗杀蔡元培。为防止北大和北大学生受损失、抗议当局的恶劣行径，5月9日，蔡元培辞去北大校长职务。1920年11月至1921年8月，蔡元培在欧洲各国考察了25所大学，在美国访问了12所大学。1921年，法国政府授予他“荣光宝星”称号，里昂大学授予他文学博士荣誉学位，纽约大学授予他法学博士荣誉学位。1927年他回国担任南京政府大学院院长(教育部长)、1928年4月任中国研究院院长，为中国教育和科研事业做出了卓越贡献。1932年底，他担任了中国民权保障同盟副主席。1939年7月，他又当选国际反侵略大会中国分会主席，为中国和世界的和平而努力。1940年3月5日，蔡元培在香港医院病逝，享年73岁。全国各地都为他举行了隆重悼念活动，中共中央向其家属发去唁电表示慰问，毛泽东在延安发出的唁电中称他为“学界泰斗，人世楷模”。